St, 26.11.2025 | Originální článek z: Phenomenex
Jak správně navýšit zatížení kolony při přechodu z analytické na preparativní HPLC? Na to najdete odpověď v tomto technickém tipu.Jak nejlépe přistoupit ke scale-upu analytické metody při jejím přenosu do preparativní chromatografie? Část druhá
Phenomenex: Jak nejlépe přistoupit ke scale-upu analytické metody při jejím přenosu do preparativní chromatografie? Část druhá
Přehled
V preparativní chromatografii jsou tři klíčové parametry: produktivita, výtěžnost a čistota. Jejich vzájemné vyvážení určuje, jakým způsobem budete postupovat při scale-upu z analytické na preparativní HPLC. Toto je část 2 této technické série.
Část 2: Kolik můžete skutečně naložit?
Zatížitelnost kolony (loadability) je pro preparativní chromatografisty zásadní parametr, protože přímo ovlivňuje průchodnost metody (throughput). Neexistuje však jednoduchá univerzální odpověď – přesto existuje několik způsobů, jak zatížitelnost stanovit.
Experimentální postup pro určení kapacity sorbentu spočívá v provedení loading studie za optimalizovaných analytických podmínek (získaných během vývoje metody). Následně se krokově zvyšuje množství vzorku, odebírají se frakce napříč píkem, který je středem zájmu a následně se hodnotí čistota získaných frakcí.
Phenomenex: Prep scale peptide flow
- A – typický chromatogram při analytickém měřítku
- B – zvýšené zatížení až na hranici dotýkajících se píků
- C – další navýšení způsobuje překryv pásů → ztráta čistoty nebo výtěžnosti
Teoretické stanovení zatížitelnosti
Pro ty, kteří chtějí provést teoretický výpočet, lze použít jednoduché pravidlo:
U správně optimalizované HPLC na reverzní fázi je minimální specifická zatížitelnost ~1 %.
- Vyjádřeno jako: g surového vzorku na 100 g stacionární fáze
U metod využívající normální fázi bývá zatížitelnost obvykle vyšší než u RP-HPLC. Tato obecná pravidla však nejsou absolutní, protože klíčové parametry separace – produktivita, výtěžnost a čistota – jsou vzájemně provázané a nelze maximalizovat všechny současně.
Skutečná zatížitelnost je tedy kompromisem mezi těmito třemi parametry.
Proto je nutné nejprve jasně definovat cíl purifikace a poté provést sérii měření při různých zatíženích a podmínkách sběru frakcí, abyste nalezli optimální nastavení.
Phenomenex: Prep scale peptide triangle
Doufáme, že pro vás byl tento technický tip užitečný. Sledujte nás pro další tipy, které vám pomohou zdokonalit vaše dovednosti v LC analýze!
Vývoj preparativní HPLC, scale-up a manipulace s preparativními kolonami
- Podívejte se na webinář ZDE.
